- Thèses - École Doctorale "Évolution Écosystèmes Microbiologie Modélisation" - PhD Thesis -
Une école doctorale de l'Université Claude Bernard Lyon1 et de L'INSA-Lyon
Robin Agnès
Email: <robin AT SPAMFREE dijon.inra DOT fr> Interactions plantes-microorganismes associées à la dynamique du fer dans la rhizosphère
Résumé
Le sujet proposé s'inscrit dans une thématique de recherches qui vise à progresser dans la connaissance de (i) l'effet de la plante sur la microflore rhizosphérique (structure et activité) et en retour de (ii) l'influence de la microflore sur la plante (croissance et santé).
L'ion Fe3+ est essentiel au métabolisme carboné et énergétique des microorganismes aérobies hétérotrophes. Dans le sol et la rhizosphère, la concentration de cet ion est faible compte tenu des caractéristiques physico-chimiques des sols (pH, pO2), de l'augmentation de la densité microbienne dans la rhizosphère et des prélèvements de fer ferrique par la plante. L'ensemble de ces observations explique la forte compétition pour Fe3+ régnant dans la rhizosphère. Compte tenu de la faible disponibilité de cet ion, différentes stratégies actives d'acquisition du fer ferrique ont été développées par les organismes vivants. Deux stratégies sont rencontrées chez les plantes selon l'espèce concernée (stratégie I pour les dicotylédones et les monocotylédones à l'exception des graminées, et stratégie II pour les graminées). Si le fer est un élément essentiel à la croissance des plantes, une concentration excessive en fer (Fe2+) s'avère toxique. Cette toxicité est liée à la grande réactivité de Fe2+ avec les formes réduites de l'oxygène, qui conduit à la production de radicaux libres via la réaction de Fenton. Les plantes disposent de systèmes de régulation de la concentration en fer libre dans les cellules basée sur le stockage du fer notamment au niveau de protéines particulières, les ferritines, localisées au niveau des plastes.
En situation de carence en fer, les microorganismes hétérotrophes aérobies ont également développé une stratégie active d'acquisition du Fe3+ basée sur la synthèse de sidérophores et de protéines membranaires réceptrices des complexes ferri-sidérophores. Cependant l'efficacité de ce système d'acquisition diffère selon les microorganismes. Ainsi, les Pseudomonas spp. fluorescents produisent des sidérophores (pyoverdines) présentant une affinité pour le fer ferrique supérieure à celle des sidérophores produits par les champignons phytopathogènes et en particulier par les Fusarium (fusarinines). Certains groupes microbiens bénéficient donc d'un avantage compétitif et sont donc antagonistes d'autres groupes microbiens, produisant des sidérophores ayant une affinité pour l'ion Fe3+ inférieure.
L'ensemble de ces observations atteste de l'importance de la compétition pour le fer dans les interactions au sein de la rhizosphère. L'intensité de cette compétition est conditionnée par l'environnement physico-chimique et par les compétiteurs en présence (plantes et microbes). Les recherches conduites jusqu'à présent, même si elles ont permis de souligner l'importance du fer dans les interactions entre organismes dans la rhizosphère, n'ont porté que sur une faible part de la microflore rhizosphérique mais surtout ont très peu pris en compte la plante-hôte.
Le projet de recherches proposé vise donc à évaluer l'impact de l'acquisition du fer par la plante sur la microflore rhizosphérique et en retour, l'influence de celle-ci sur la plante. La stratégie adoptée consiste à comparer la microflore associée aux racines de tabac sauvage et d'un mutant surexpresseur de ferritine pour lequels, la quantité de fer stockée est augmentée. L'effet de l'activation de l'acquisition du fer par le mutant surexpresseur de ferritine sur la biodisponibilité du fer dans la rhizosphère sera évalué grâce à l'utilisation de souches microbiennes chez lesquelles le gène rapporteur inaZ a été placé sous contrôle du promoteur de la synthèse de pyoverdine. De même, l'environnement physico-chimique de la rhizosphère sera appréhendé. La microflore rhizosphérique du type sauvage et du mutant surexpresseur de ferritine sera caractérisée à trois niveaux d'intégration : communautés, populations, souches modèles. La structure des communautés microbiennes sera analysée directement à partir de l'ADN, extrait du sol rhizosphérique, par analyse du polymorphisme de taille des intergènes ribosomiques automatisée (RISA). Les groupes microbiens préférentiellement associés à la rhizosphère du mutant surexpresseur de ferritine seront identifiés par clonage et séquençage des bandes majeures des profils RISA correspondants. La diversité génotypique (aptitude à mobiliser le fer), et phénotypique des populations correspondantes sera caractérisée. Des souches représentatives des populations dominantes seront sélectionnées ; leur activité antagoniste ainsi que leur compétitivité dans la rhizosphère du type sauvage et du mutant seront analysées.
Résumé de la thèse
Le fer ferrique est un élément essentiel au métabolisme carboné et énergétique des organismes aérobies. Dans la rhizosphère, la concentration de cet ion est faible compte tenu des caractéristiques physico-chimiques des sols (pH, pO2) et des prélèvements de fer par la plante et la microflore. L'objectif de ce travail de thèse était d'évaluer l'influence de la nutrition en fer de la plante sur la microflore rhizosphérique et en retour, celle de la microflore sur la nutrition en fer de la plante.
L'influence de la nutrition en fer de la plante sur la microflore rhizosphérique a été étudiée en comparant la bactérioflore associée aux racines d'un tabac sauvage à celle d'un transgène surexpresseur de ferritine (P6). La ferritine est une protéine de stockage du fer assurant son homéostasie. Les conditions expérimentales favorables à la sur-accumulation de fer chez le transgène ont été précisées. Cette sur-accumulation s'est accompagnée de la sélection par le transgène d'une microflore moins sensible à la carence en fer que celle associée au type sauvage, suggérant une diminution de la biodisponibilité en fer dans la rhizosphère correspondante. Les communautés bactériennes associées aux deux génotypes de plantes ont été comparées, à partir d'ADN extrait de l'environnement rhizosphérique. Les communautés totales ont été caractérisées par analyse automatisée du polymorphisme de taille des intergènes ribosomiques (A-RISA), et les communautés d'un groupe bactérien (Pseudomonas) par PCR-RFLP à l'aide d'amorces spécifiques. Des différences significatives de structure ont été observées entre les communautés associées au type sauvage et au transgène, ces différences étant les plus marquées pour les communautés de Pseudomonas. L'effet de la sur-accumulation de fer par le transgène sur ce groupe bactérien a été précisé en caractérisant la structure et la diversité d'une large collection (733) d'isolats de Pseudomonas spp. fluorescents. Les populations de Pseudomonas isolées des deux génotypes de tabac ont été différenciées au niveau phénotypique (croissance en milieu carencé en fer, diversité des pyoverdines) et au niveau génotypique (Random Amplified Polymorphism DNA). Cette différentiation a été la plus marquée chez les isolats issus des tissus racinaires. Il apparait en particulier que les populations associées au transgène surexpresseur de ferritine présentent une meilleure aptitude à se développer en milieu carencé en fer que celle associées au type sauvage. Des isolats représentatifs de la diversité des populations associées aux tissus racinaires ont été sélectionnés et testés pour leur activité antagoniste à l'encontre de champignons phytopathogènes en milieu carencé en fer. L'activité antagoniste des isolats associés au transgène est apparue très significativement supérieure à celle des isolats issus du type sauvage. La supplémentation en fer s'est accompagnée de la suppression de la synthèse de pyoverdine et, pour certains isolats, de l'activité antagoniste, suggérant que l'antagonisme bactérien était associé à la compétition pour le fer déterminé par la pyoverdine. Pour d'autres isolats, l'activité antagoniste a été maintenue suggérant la synthèse d'antibiotiques non régulée par la concentration enfer du milieu.
L'influence de la pyoverdine, produite par une souche antagoniste de champignons phytopathogènes (P. fluorescens C7), sur la nutrition en fer d' Arabidopsis thaliana a été évaluée. La nutrition en fer des écotypes sauvage (Col et Ws), d'un mutant affecté dans le transporteur du fer IRT1 (KO IRT1) et d'un transgène surexpresseur de ferritine (OV ferritine) a été comparée en présence de Fe-pyoverdine et de Fe-EDTA. Chez le type sauvage, la nutrition en fer et la croissance de la plante ont été significativement supérieures en présence de Fe-pyoverdine qu'en présence de FeEDTA. Ce différentiel a été exprimé avec plus d'intensité chez le transgène OV ferritine mais surtout chez le mutant KO IRT1. Cette dernière observation suggère la présence d'un autre transporteur que IRT1 pour l'incorporation du fer chélaté à la pyoverdine. Le rôle de la Fe-pyoverdine a été conforté par la quantification de la pyoverdine in planta par sérologie et marquage isotopique.
Au total, les résultats obtenus au cours de la thèse indiquent l'intéret de modifier l'environnement rhizosphérique via la culture de génotypes de plantes affectés dans des phénotypes bien identifiés pour les études d'écologie microbienne. De façon plus spécifique, ils montrent le rôle de la compétition pour le fer dans la structuration des communautés bactériennes, en particulier de Pseudomonas, et en retour l'effet de sidérophore bactérien sur la nutrition en fer de la plante.
Equipe
Dynamique des interactions plantes-microorganismes UMR 1229 Microbiologie et Géochimie des Sols Unité Mixte de Recherche INRA/Université de Bourgogne Responsable
Philippe Lemanceau Directeur thèse
Lemanceau Philippe Co-Directeur
Mougel Christophe Coencadrants
Vansuyt Gérard et Mazurier Sylvie DiplomeOrigine
DEA d'Ecologie Microbienne (19910505)
Page Perso
Espace laissé à disposition pour le doctorant
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