L'activité scientifique de l'Unité du Choléra et des Vibrions concerne deux domaines : les vibrions cholériques et les vibrions non cholériques. De très nombreux pays sont encore touchés pas des épidémies de choléra. Nous contribuons à la lutte contre ce fléau par : (1) la mise au point d'un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini; (2) le développement d'un test de diagnostic rapide du choléra ; (3) l'épidémiologie moléculaire du choléra. Notre laboratoire est désigné, par le Ministère de la Santé, "Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra" en raison de son expertise dans le domaine des vibrions cholériques et non cholériques.

1. Programme de recherche sur un nouveau vaccin conjugué chimiquement défini contre le choléra (Alain BOUTONNIER, Bruno DASSY, Jean-Michel FOURNIER)

Le choléra est une maladie diarrhéique épidémique provoquée par des bactéries appartenant à 2 sérogroupes de l'espèce Vibrio cholerae. Nous sommes actuellement dans la 7^ème pandémie qui a débuté en Inde en 1961, envahi l'Afrique en 1970 et atteint l'Amérique Latine en 1991. Cette 7^ème pandémie est due à V. cholerae sérogroupe O1, biotype El Tor, sérotypes Ogawa ou Inaba. Un nouveau sérogroupe de V. cholerae, O139, apparu en Inde en 1992, est actuellement en expansion en Inde et au Bangladesh et représente une menace mondiale. C'est pourquoi il est urgent de pouvoir disposer d'un vaccin anticholérique protégeant aussi bien contre V. cholerae O1 que contre V. cholerae O139, efficace à long terme chez tous les groupes d'âge, en particulier chez les enfants de moins de 5 ans.

Le point de départ de notre recherche a été de déterminer quels anticorps protègent l'homme contre le choléra. Nous avons démontré que des immunoglobulines G (IgG) monoclonales, dirigées contre la partie polysaccharidique du lipopolysaccharide (LPS) de V. cholerae O1, porteuse de la spécificité des sérogroupes et sérotypes, sont protectrices dans un modèle d'infection expérimentale du souriceau nouveau-né. Nous avons alors commencé la préparation de vaccins anticholériques conjugués, constitués de polysaccharides de V. cholerae O1 ou de V. cholerae O139 couplés par une liaison covalente à une protéine porteuse de façon à induire une réponse thymodépendante de longue durée. Nous avons obtenu un vaccin, constitué du polysaccharide du LPS de V. cholerae O139 conjugué à l'anatoxine tétanique, qui induit chez la souris une réponse protectrice thymodépendante.

Cette année, nous avons poursuivi la préparation de l'évaluation clinique de ce vaccin conjugué dirigé contre V. cholerae O139. Pour cela, nous avons procuré une assistance technique à une société pharmaceutique produisant un lot " clinique " de conjugué O139. Nous avons aussi commencé une étude de la structure chimique du LPS de V. cholerae O1. Nous avons enfin préparé de nouveaux conjugués constitués du polysaccharide du sérotype Inaba de V. cholerae O1. L'immunogénicité de ces conjugués est en cours d'étude chez la souris.

Le titre d'anticorps vibriocides sériques permet de prédire la résistance au choléra et représente aujourd'hui le seul paramètre sérique corrélé à la protection contre cette maladie. Nous avons développé une méthode de titrage de ces anticorps en microplaque, simple et pratique, efficace pour le titrage des anticorps anti-V. cholerae O1 et anti-V. cholerae O139. Une épidémie de choléra étant apparue à Madagascar en 1999, pour la première fois dans l'histoire de l'île, nous avons utilisé cette méthode pour étudier, en collaboration avec l'Institut Pasteur de Madagascar, l'immunité anticholérique de populations malgaches. Cette méthode sera aussi mise en oeuvre dans le cadre de l'essai clinique programmé avec le conjugué O139, pour le titrage des anticorps vibriocides chez les volontaires.

2. Développement de tests de diagnostic rapide du choléra (Alain BOUTONNIER, Jean-Michel FOURNIER)

Dans le cadre de notre programme de recherche sur la vaccination contre le choléra, nous avions préparé des anticorps monoclonaux spécifiques des LPS de V. cholerae O1 et O139. Nous avons utilisé ces anticorps pour développer, en collaboration avec le Laboratoire d'Ingénierie des Anticorps de l'Institut Pasteur à Paris et avec l'Institut Pasteur de Madagascar, des tests de diagnostic rapide du choléra, fondés sur le principe de l'immunochromatographie. Leur sensibilité et leur spécificité ont été étudiées au laboratoire et sur le terrain dans deux pays du monde, Madagascar et Bangladesh, où le choléra est épidémique. Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Centre International de Recherche sur les Maladies Diarrhéiques, à Dacca au Bangladesh (ICDDR,B). La spécificité varie de 84 à 100% et la sensibilité de 94,2 à 100%. Ces tests ont aussi été évalués au Bangladesh, pour rechercher V. cholerae O1 et V. cholerae O139 dans des cultures de 4 heures en eau peptonée alcaline, réalisées à partir d'écouvillons rectaux prélevés chez des patients hospitalisés. La sensibilité et la spécificité sont respectivement de 92% et 91%. Ces tests sont les premiers tests capables de détecter V. cholerae O1 et V. cholerae O139 à partir d'écouvillons rectaux, et devraient contribuer de façon importante à l'amélioration de la surveillance du choléra, particulièrement dans les régions reculées.

3. Études moléculaires des vibrions cholériques (Marie-Laure QUILICI)

Seuls 2 sérogroupes, parmi plus de 200 décrits au sein de l'espèce V. cholerae, sont responsables des pandémies cholériques actuelles : le sérogroupe O1, responsable de la 7^ème pandémie, et le sérogroupe O139, qui a émergé en 1992. Néanmoins, la progression inexorable de cette maladie à travers le monde depuis la première pandémie, qui a débuté en Inde en 1817, a été accompagnée d'une diversification des populations de vibrions cholériques. Le développement des méthodes de typage moléculaire nous a permis d'étudier cette évolution sur le continent africain. L'étude, par ribotypage et par électrophorèse en champ pulsé, de 350 souches de V. cholerae O1 isolées dans des pays africains entre 1970 et 2000, nous a permis de différencier 14 ribotypes et un nombre plus important de pulsotypes. L'analyse de ces profils montre un degré élevé d'homologie génétique parmi des souches d'origines géographiques diverses et parfois prélevées à plusieurs dizaines d'années d'intervalle, ainsi que la persistance de souches isolées dès le début de la 7^ème pandémie en Afrique.

4. Études moléculaires des vibrions non cholériques (Annick ROBERT-PILLOT, Marie-Laure QUILICI)

Les vibrions sont des bactéries à Gram négatif qui colonisent l'environnement marin. On distingue les "vibrions cholériques", incluant les isolats appartenant aux sérogroupes O1 et O139 de l'espèce V. cholerae, et les "vibrions non cholériques", incluant les isolats de cette espéce appartenant aux sérogroupes autres que O1 et O139 - appelés V. cholerae non-O1/non-O139 - et les isolats appartenant aux autres espèces du genre Vibrio, comprenant deux espèces plus fréquemment isolées en pathologie humaine : V. parahaemolyticus et V. vulnificus, et quatre autres espèces plus rarement isolées : V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hollisae et V. mimicus.

Les modifications écologiques de l'environnement marin fournissent aux vibrions des conditions idéales pour leur prolifération. Le développement du commerce international et de la consommation des produits de la mer à l'état cru, ainsi que l'accroissement du nombre de personnes immunodéprimées, font craindre une augmentation du nombre d'infections dues aux vibrions non cholériques dans les pays européens. Aussi, une surveillance microbiologique de ces germes devraient contribuer à en limiter les risques pour la santé publique.

Nous avons collaboré à la recherche d'espèces de vibrions potentiellement pathogènes dans l'environnement marin des côtes et estuaires français, avec l'Ifremer (Brest) et le Centre de Biotechnologie Marine de Baltimore aux Etats-Unis. V. alginolyticus est l'espèce prédominante (99 souches sur un total de 189), suivie par V. parahaemolyticus (41/189), V. vulnificus (20/189), et V. cholerae non-O1/non-O139 (3/189). Les souches ont été détectées, identifiées et caractérisées par des méthodes biochimiques classiques ainsi que par des méthodes moléculaires (PCR). Deux des 41 souches de V. parahaemolyticus étudiées possédaient le gène de l'hémolysine TRH. Ces résultats démontrent la présence de vibrions pathogènes dans les eaux côtières françaises et suggèrent qu'un programme de surveillance visant à rechercher les isolats pathogènes de V. parahaemolyticus dans les eaux côtières et dans les produits de la mer français devrait être mis en place.

5. Activités du Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra (Marie-Laure QUILICI, Jean-Michel FOURNIER)

Le CNRVC est responsable de l'identification des souches de vibrions cholériques à l'origine de cas de choléra survenant en France, où, comme dans de nombreux pays, cette maladie est à déclaration obligatoire. Un faible nombre de cas de choléra (0 à 5) surviennent chaque année en France et sont, pour la plupart, importés. Aucun cas n'a été identifié en 2003. Nous collaborons aussi avec des biologistes de pays concernés par des épidémies de choléra et avec des organisations non gouvernementales, ce qui nous permet d'étudier de nouvelles souches de vibrions cholériques susceptibles d'être importées en France.

Le CNRVC est aussi responsable de l'identification de souches de vibrions non cholériques d'origine humaine. Ces vibrions non cholériques sont à l'origine de gastro-entérites, d'infections de la peau et des tissus mous, de septicémies, et de diverses infections extra-intestinales comme des otites. Les patients ayant une pathologie sous-jacente immunosuppressive sont exposés à une dissémination rapide de l'infection causée par ces germes. Dans la majorité des cas, ces infections sont associées à un contact direct avec l'eau de mer ou à la consommation de produits de la mer, et surviennent pendant les mois les plus chauds de l'année.

En 2003, 11 cas humains d'infections à vibrions non cholériques ont été identifiés par le CNRVC. Six cas de septicémies, gastro-entérites ou infections des tissus mous ont été causés par V. cholerae non-O1/non-O139, 2 cas de gastro-entérites et 1 cas d'infection des tissus mous par V. parahaemolyticus, et 2 cas de septicémie et d'infections des tissus mous étaient dus à V. vulnificus.

Le CNRVC est aussi responsable de l'identification de souches de vibrions non cholériques isolées de produits de la mer importés en France. En 2003, parmi les 255 souches étudiées, les espèces V. cholerae, V. parahaemolyticus et V. alginolyticus ont été le plus souvent rencontrées. Tous les isolats, cliniques ou alimentaires, de V. vulnificus possédaient le gène hly, indiquant que toutes les souches de cette espèce sont potentiellement pathogènes. Deux isolats humains sur 3 de V. parahaemolyticus possédaient le gène de l'hémolysine TDH, alors qu'un très faible pourcentage (<1%) de souches de V. parahaemolyticus isolées de produits de la mer importés possédaient un gène d'hémolysine. Aucune des souches de V. cholerae non-O1/non-O139 isolées de l'homme ou du milieu marin ne possédait les gènes de la toxine cholérique.

Le CNRVC a participé a des enseignements post-universitaires. Il a aussi été impliqué dans la formation de microbiologistes et de cliniciens. Des formations sur les méthodes classiques et moléculaires d'étude des vibrions cholériques et non cholériques ont été dispensées à des microbiologistes, techniciens et étudiants de plusieurs pays (France, Bangladesh, Madagascar, Maroc, Mexique et République Démocratique du Congo). Le CNRVC a également participé a des comités d'experts nationaux et internationaux sur la vaccination contre le choléra et l'évaluation de risque des vibrions dans les produits de la mer.

Mots-clés: choléra, vibrions, vaccination, conjugué, diagnostic, épidémiologie moléculaire, produits de la mer, santé publique